人类基因组定量及质检试剂盒

人类基因组DNA定量及质检试剂盒--.pdf

1)定量低浓度的样本 DNA;   2)质检来源复杂的样本 DNA,如 FFPE;   3)预测文库构建的成功概率、扩增产量和片段大小。

二代测序中样本 DNA 的质量和数量对文库构建的结果具有非常大的影响。KAPA 人类基因组 DNA 文库定量及质控试剂盒主要用来解决二代测序文库文库构建前模板 DNA 定量和质检的。

 1、样本涵盖


1)福尔马林固定组织样本(FFPE),其 DNA 损坏程度较重;

 2)激光显微切割捕获的样本;


 3)提取自流式细胞的 DNA;


4)血浆或血清中的游离 DNA;

 5)其他微量或非常珍贵的临床样本。

2、准确定量低浓度 DNA: qPCR 法定量低浓度 DNA,结果更准.

目前二代测序文库构建时,常规主要采用分光光度计和电泳法进行定量(例如 NanoDrop, PicoGreen 或 Bioanalyzer),而其结果往往与真实结果存在较大的出入,主要缺点体现在: 1)样本稀释后定量不准;2)无法区 分总 DNA 中的有效 DNA 片段; 3)对污染物敏感,导致测定的有效目的 DNA 浓度过高或过低。

上图所示,6 个 2 倍浓度梯度稀释的 DNA 样品,从 2.5ng/μl 到 0.09ng/μl,分别用 NanoDrop, PicoGreen、qPCR 法进行定量。结果显示 qPCR 法的结果更准,均匀性更好。

 3、利用 Q-比值来评价模板 DNA 的质量

如上图所示:相同的标准品设置,产生三种标准曲线,扩增高度保守的人类单拷贝数基因,片段长度分别为 41bp、 129bp、305bp。其中 41bp 的片段被用来对样本进行绝对定量。而 129bp、305bp 片段来判断 DNA 的质量。DNA 质 量不高会严重影响较长片段的扩增效率,因此可通过 Q-129、Q-305 与 Q-41 的比值,来推断样本 DNA 的质量。通过 “Q-比值”,可以推测模板 DNA 的质量并预测文库构建和测序的成功概率。

 4、通过 Q-比值来预测 FFPE 来源样本文库构建的成功概率

上图:FFPE 样本来源 DNA 的 Q- 比值与文库构建后产量的关系。 样本 DNA 质量差,直接降低文库 扩增的效率,尤其是片段长度稍 长的情况下。一般情况下,用较 短片段的 Q-比值(Q-41)来进行 定量,用较长片段的 Q-比值 (Q-129、Q-305)来判断文库 DNA 的质量。左图通过 Q-比值来 推断5个人类FFPE来源DNA样 本的质量。这些样本的 Q-比值与 文库构建(Library Construcion,LC) 的质量有非常大的直接关系。(数 据来源:Mirna Jarosz 和 Frank Juhn, Fundation Medicine, Cambridge , MA, USA)。

 5、通过 Q-比值来推测片段大小和测序的质量


从人类全基因组测序结果中挑选 10 个人类基因组样本,其尺寸的实际片段大小(~bp)与预测值相比偏小。 所有的样本都是通过标准的文库构建流程进行全基因组测序,模板 DNA的起始量为100ng。采用Sage SciencePippin Prep 选择片段,割胶选择 500bp 左右。

上图:Q305/Q41 的比值由上至下 逐渐降低,主要说明:

 1)样本 DNA 打断后,尺寸大小由 上至下逐渐降低;

2)测序的文库片段 中,小片段的量增多。既使严格地选择片段尺寸,仍然会 有会有很多小片段,这一点通过 Q-比 值也可以看出,小片段的存在会影响文 库质量。 (数据来源:Kathleen Steinmann, Sharon Kim 和 Maura Costello,Broad Institute,MA,USA)

 6、产品信息

注:试剂盒内的 DNA 标准品和引物可单独购买。